Antikörper-Partikelkonjugate zur retadierten Freisetzung von Ektoparasitiziden
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Sprache:Deutsch
31,99 €
inkl. gesetzl. MwSt.,
Beschreibung
Produktdetails
Einband
Taschenbuch
Erscheinungsdatum
13.12.2012
Verlag
Cuvillier, ESeitenzahl
153
Maße (L/B/H)
21/14,8/0,9 cm
Gewicht
209 g
Auflage
1. Auflage
Sprache
Deutsch
ISBN
978-3-86955-954-4
Die vorliegende Arbeit thematisiert die Biokonjugation von Antikörpern an
Mikropartikel, welche mit Flumethrin beladen sind. Die erhaltenen
Antikörper-Partikelkonjugate sind zur ektoparasitiziden Anwendung auf dem Fell von
Hunden bestimmt. Es werden Partikel von 1 – 2 µm Größe (d90-Wert der
Volumenverteilung) verwendet. Diese bestehen aus dem nicht bioabbaubaren Polymer
Polystyrol und sind auf dem Fell aufgrund ihrer Größe nicht sichtbar. Die Partikel
wurden mittels Emulsion-Evaporation Verfahren, wie unter (B.4) beschrieben,
hergestellt. Zur Konjugation der Proteine sind die Partikel mit Carboxylgruppen
modifiziert. Die Anbindung der Proteine kann auf verschiedenen Wegen erfolgen,
wobei zwischen ungerichteten und gerichteten Anbindungsstrategien (A.1.2)
unterschieden werden kann. Insgesamt werden drei Synthesewege durchgeführt und
evaluiert. Die Carbodiimid-Synthese, eine ungerichtete Anbindung, wird vergleichend
mit der Polysaccharid-Synthese, welche eine gerichtete Anbindung ist, untersucht. Eine
Synthese über Thioetherbindungen, die ebenfalls zu einer gerichteten Anbindung führt,
wurde praktiziert, aber aufgrund von wenig aussichtsreichen Resultaten nicht weiter
verfolgt (C.3.2.2). Die Charakterisierung der AK-Partikelkonjugate wird auf zwei
prinzipiell unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Hierzu ist eine Unterteilung in eine
chemisch-physikalische und eine funktionelle Analytik zweckmäßig. Während
funktionelle Analysenverfahren die Bindungsfähigkeit von AK-Partikelkonjugaten
bewerten, weisen chemisch-physikalische Analysenverfahren (geänderte)
physikochemische Eigenschaften nach, ohne eine Aussage zu machen, ob das erhaltene
Konjugat die Funktionalität der Einzelkomponenten vereint.
Bei letzterem steht die Analytik mit spektroskopischen Methoden, nasschemischen
Nachweisen, sowie den physikalischen Eigenschaften der Partikel im Vordergrund. So
können durch Messungen des Zetapotentials unter Variation des pH-Wertes
Oberflächenmodifikationen im Verlauf von Aktivierungs- und Konjugationsreaktionen
mit Antikörpern im Detail nachvollzogen werden (C.2.1.1, C.2.2.1). Die einzelnen
Aktivierungsschritte der Carbodiimid-Synthese lassen sich mit dieser Methodik zeigen
und in Bezug auf ihre Reaktionsgeschwindigkeit charakterisieren. Auch Anbindungen
von Antikörper sind in einer Verschiebung des Zetapotentials zu größeren Werten zu
sehen. Dies ist durch das Vorhandensein von basischen funktionellen Gruppen der
Antikörper zu erklären. Weiterhin kann mittels Röntgenelektronen-Spektroskopie die
Anwesenheit von Proteinen auf den Mikropartikeln nachgewiesen werden. Hier zeigt
sich nach erfolgter Konjugation ein deutliches Signal von Elementen, wie Stickstoff,
Sauerstoff und Schwefel, welche in erhöhten Mengen in der Struktur des Antikörpers
vorkommen (C.2.2.2). Ein fluorimetrischer Nachweis von Antikörpern auf Partikeln
unter Verwendung von o-Phtaldialdehyd kann durchgeführt werden (C.2.1.3). Eine
Untersuchung der Anbindung von Antikörpern an Partikel ist zudem durch
Raster-Kraft-Mikroskopie möglich (C.2.2.3). Die Auflagerung der Antikörper verändert
hierbei das Profil der Partikeloberfläche gegenüber unmodifizierten Partikeln.
Um der Frage nach der Konjugations-Synthese mit der größtmöglichen
Bindungsaffinität nachzugehen, wird ein funktioneller Assay entwickelt, der auf
mehreren sequenziellen Filtrationsvorgängen beruht und die Menge an Flumethrin an
einer Haarprobe quantifiziert (C.1). Die Validität dieses Assays wird nach
ICH Guideline Q2(R1) für bioanalytische Verfahren untersucht und entspricht den
Anforderungen dieser Guideline. Mit der Methodik kann die Zunahme der
Bindungsaffinität von AK-Partikelkonjugaten gegenüber unkonjugierten Partikeln
gezeigt werden (C.2.2.4). Eine Inkubation der AK-Partikelkonjugate mit verschiedenen
denaturierenden Agenzien führt, wie erwartet, zu einem Bindungsabfall (C.1.9). Diese
Befunde sind elementar und unterstreichen die Validität des Assays. Werden Antikörper
in einer Orientierung an Partikel gebunden, in der die antigenbindenden Domänen von
der Oberfläche herausragen, wird von einer gerichteten Synthese gesprochen. Von
diesen AK-Partikelkonjugaten ist eine erhöhte Bindungsaffinität zu erwarten, da keine
sterische Behinderung der Antikörper-Antigen-Bindung besteht. Mit dem entwickelten
Assay gemessene Bindungen von AK-Partikelkonjugaten, die nach der gerichteten
Polysaccharid-Synthese erzeugt sind, sind den, mittels ungerichteter
Carbodiimid-Synthese generierten, Konjugaten überlegen (C.3.2). Diese Feststellung ist
zu erwarten und in Übereinstimmung mit der Literatur.
Ein Phänomen, welches bei verschiedenen Konjugations-Synthesen zu beobachten ist,
ist eine Agglomeration der erhaltenen AK-Partikelkonjugate. Es wird die Hypothese
formuliert, dass dies durch polyionische Wechselwirkungen von dissoziierbaren
funktionellen Gruppen auf den Partikeloberflächen nach der Konjugation zu begründen
ist. Berechnete Ladungsheterogenitäten lassen sich sehr gut mit experimentell
ermittelten Partikelgrößen korrelieren, die mittels Laserdiffraktometrie erhoben wurden
(C.3.3.2).
Eine klinische Untersuchung der Wirkung von flumethrinbeladenen
AK-Partikelkonjugaten gegenüber Zecken an Hunden und eine begleitende
HPLC-Analytik von Flumethrin aus Fellproben wurde, nach Validierung dieser,
durchgeführt (C.4). Die Wirksamkeit gegenüber Zecken ist in diesem Tierversuch
lediglich vergleichbar mit einer nichtretardierten Formulierung von Flumethrin. Eine
mögliche Ursache hierfür kann in einer verminderten Stabilität des Antikörpers auf
Fellproben bei erhöhten Lagertemperaturen gefunden werden (C.4.5).
Zusammenfassend kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Konjugation von
spezifischen Antikörpern gegen Hundehaar an flumethrinbeladene Mikropartikel
gelingt. Verschiedene analytische Methoden werden zur Charakterisierung der
AK-Partikelkonjugate herangezogen. Die Bindungsfähigkeit an Hundehaar kann in vitro
durch den Einsatz einer hierfür entwickelten, funktionellen analytischen Methode
gezeigt werden. Allerdings ist in Bezug auf die klinische Wirksamkeit gegenüber einer
nichtretardierten Darreichungsform keine verbesserte Wirkdauer festzustellen.
Mikropartikel, welche mit Flumethrin beladen sind. Die erhaltenen
Antikörper-Partikelkonjugate sind zur ektoparasitiziden Anwendung auf dem Fell von
Hunden bestimmt. Es werden Partikel von 1 – 2 µm Größe (d90-Wert der
Volumenverteilung) verwendet. Diese bestehen aus dem nicht bioabbaubaren Polymer
Polystyrol und sind auf dem Fell aufgrund ihrer Größe nicht sichtbar. Die Partikel
wurden mittels Emulsion-Evaporation Verfahren, wie unter (B.4) beschrieben,
hergestellt. Zur Konjugation der Proteine sind die Partikel mit Carboxylgruppen
modifiziert. Die Anbindung der Proteine kann auf verschiedenen Wegen erfolgen,
wobei zwischen ungerichteten und gerichteten Anbindungsstrategien (A.1.2)
unterschieden werden kann. Insgesamt werden drei Synthesewege durchgeführt und
evaluiert. Die Carbodiimid-Synthese, eine ungerichtete Anbindung, wird vergleichend
mit der Polysaccharid-Synthese, welche eine gerichtete Anbindung ist, untersucht. Eine
Synthese über Thioetherbindungen, die ebenfalls zu einer gerichteten Anbindung führt,
wurde praktiziert, aber aufgrund von wenig aussichtsreichen Resultaten nicht weiter
verfolgt (C.3.2.2). Die Charakterisierung der AK-Partikelkonjugate wird auf zwei
prinzipiell unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Hierzu ist eine Unterteilung in eine
chemisch-physikalische und eine funktionelle Analytik zweckmäßig. Während
funktionelle Analysenverfahren die Bindungsfähigkeit von AK-Partikelkonjugaten
bewerten, weisen chemisch-physikalische Analysenverfahren (geänderte)
physikochemische Eigenschaften nach, ohne eine Aussage zu machen, ob das erhaltene
Konjugat die Funktionalität der Einzelkomponenten vereint.
Bei letzterem steht die Analytik mit spektroskopischen Methoden, nasschemischen
Nachweisen, sowie den physikalischen Eigenschaften der Partikel im Vordergrund. So
können durch Messungen des Zetapotentials unter Variation des pH-Wertes
Oberflächenmodifikationen im Verlauf von Aktivierungs- und Konjugationsreaktionen
mit Antikörpern im Detail nachvollzogen werden (C.2.1.1, C.2.2.1). Die einzelnen
Aktivierungsschritte der Carbodiimid-Synthese lassen sich mit dieser Methodik zeigen
und in Bezug auf ihre Reaktionsgeschwindigkeit charakterisieren. Auch Anbindungen
von Antikörper sind in einer Verschiebung des Zetapotentials zu größeren Werten zu
sehen. Dies ist durch das Vorhandensein von basischen funktionellen Gruppen der
Antikörper zu erklären. Weiterhin kann mittels Röntgenelektronen-Spektroskopie die
Anwesenheit von Proteinen auf den Mikropartikeln nachgewiesen werden. Hier zeigt
sich nach erfolgter Konjugation ein deutliches Signal von Elementen, wie Stickstoff,
Sauerstoff und Schwefel, welche in erhöhten Mengen in der Struktur des Antikörpers
vorkommen (C.2.2.2). Ein fluorimetrischer Nachweis von Antikörpern auf Partikeln
unter Verwendung von o-Phtaldialdehyd kann durchgeführt werden (C.2.1.3). Eine
Untersuchung der Anbindung von Antikörpern an Partikel ist zudem durch
Raster-Kraft-Mikroskopie möglich (C.2.2.3). Die Auflagerung der Antikörper verändert
hierbei das Profil der Partikeloberfläche gegenüber unmodifizierten Partikeln.
Um der Frage nach der Konjugations-Synthese mit der größtmöglichen
Bindungsaffinität nachzugehen, wird ein funktioneller Assay entwickelt, der auf
mehreren sequenziellen Filtrationsvorgängen beruht und die Menge an Flumethrin an
einer Haarprobe quantifiziert (C.1). Die Validität dieses Assays wird nach
ICH Guideline Q2(R1) für bioanalytische Verfahren untersucht und entspricht den
Anforderungen dieser Guideline. Mit der Methodik kann die Zunahme der
Bindungsaffinität von AK-Partikelkonjugaten gegenüber unkonjugierten Partikeln
gezeigt werden (C.2.2.4). Eine Inkubation der AK-Partikelkonjugate mit verschiedenen
denaturierenden Agenzien führt, wie erwartet, zu einem Bindungsabfall (C.1.9). Diese
Befunde sind elementar und unterstreichen die Validität des Assays. Werden Antikörper
in einer Orientierung an Partikel gebunden, in der die antigenbindenden Domänen von
der Oberfläche herausragen, wird von einer gerichteten Synthese gesprochen. Von
diesen AK-Partikelkonjugaten ist eine erhöhte Bindungsaffinität zu erwarten, da keine
sterische Behinderung der Antikörper-Antigen-Bindung besteht. Mit dem entwickelten
Assay gemessene Bindungen von AK-Partikelkonjugaten, die nach der gerichteten
Polysaccharid-Synthese erzeugt sind, sind den, mittels ungerichteter
Carbodiimid-Synthese generierten, Konjugaten überlegen (C.3.2). Diese Feststellung ist
zu erwarten und in Übereinstimmung mit der Literatur.
Ein Phänomen, welches bei verschiedenen Konjugations-Synthesen zu beobachten ist,
ist eine Agglomeration der erhaltenen AK-Partikelkonjugate. Es wird die Hypothese
formuliert, dass dies durch polyionische Wechselwirkungen von dissoziierbaren
funktionellen Gruppen auf den Partikeloberflächen nach der Konjugation zu begründen
ist. Berechnete Ladungsheterogenitäten lassen sich sehr gut mit experimentell
ermittelten Partikelgrößen korrelieren, die mittels Laserdiffraktometrie erhoben wurden
(C.3.3.2).
Eine klinische Untersuchung der Wirkung von flumethrinbeladenen
AK-Partikelkonjugaten gegenüber Zecken an Hunden und eine begleitende
HPLC-Analytik von Flumethrin aus Fellproben wurde, nach Validierung dieser,
durchgeführt (C.4). Die Wirksamkeit gegenüber Zecken ist in diesem Tierversuch
lediglich vergleichbar mit einer nichtretardierten Formulierung von Flumethrin. Eine
mögliche Ursache hierfür kann in einer verminderten Stabilität des Antikörpers auf
Fellproben bei erhöhten Lagertemperaturen gefunden werden (C.4.5).
Zusammenfassend kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Konjugation von
spezifischen Antikörpern gegen Hundehaar an flumethrinbeladene Mikropartikel
gelingt. Verschiedene analytische Methoden werden zur Charakterisierung der
AK-Partikelkonjugate herangezogen. Die Bindungsfähigkeit an Hundehaar kann in vitro
durch den Einsatz einer hierfür entwickelten, funktionellen analytischen Methode
gezeigt werden. Allerdings ist in Bezug auf die klinische Wirksamkeit gegenüber einer
nichtretardierten Darreichungsform keine verbesserte Wirkdauer festzustellen.
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